Proteinas K -pulverär ett mycket effektivt, icke-specifikt serinproteas som används i stor utsträckning i molekylärbiologi och biokemi, främst för nedbrytande proteiner och avlägsnande av förorenande proteiner från nukleinsyror. Det härstammar från svampen Engyodontium-albumet (tidigare Tritirachium-album) och upprätthåller sin aktivitet över ett brett spektrum av temperaturer (20-60 grader) och pH (4-12), även när de inkuberas i en lösning som innehåller SD: er (0,5-1%) eller urea (4M) under denaturerande förhållanden.
Det enzymet bryter effektivt ner ett brett spektrum av proteiner, inklusive RNas och DNas, genom klyvning av peptidbindningar (företrädesvis hydrolysering av karboxylterminalen av alifatiska/aromatiska aminosyror) och används därför för nukleasborttagning i DNA/RNA -extraktion för att säkerställa nuphinsyra. Dessutom används det ofta i vävnadsspjälkning (t.ex. paraffin-inbäddade prover), celllys och proteomikstudier.
Proteinas K-pulver levereras vanligtvis i lyofiliserad form, vilket är mycket stabilt (-20 grader för långvarig lagring) och måste lösas i en buffert (t.ex. Tris-HCl, EDTA) före användning. Dess aktivitet är beroende av Ca²⁺, men kelaterande medel som EDTA bara delvis hämmar enzymaktivitet. Självnedbrytning måste undvikas under hantering och värmeinaktivering vid 65 grader rekommenderas. På grund av dess potenta proteinhydrolyseringsförmåga krävs noggrant skydd för att undvika hud- eller slemhinnekontakt.
Proteinas K -pulver, även känd som proteinas K eller EC 3.4.21.14, är en serinproteasisolerad och renad från Tritirachium -album Limber. Sedan den första isoleringen av Wolfgang Ebeling et al. 1974 har proteinas K använts i stor utsträckning inom biokemi, molekylärbiologi, medicin och industri på grund av dess höga aktivitet och breda substratspecificitet.
Applikationer inom biokemi och molekylärbiologi
I processen med DNA- och RNA -extraktion är huvudfunktionen för proteinas K att försämra proteiner bundna till nukleinsyror, vilket gör att DNA eller RNA kan vara fritt i lösning för efterföljande extraktion och rening. På grund av dess stabilitet och höga aktivitet i denatureringsmedel såsom urea och SDS, används proteinas K vanligtvis för isolering av plasmider eller genomiskt DNA och RNA.
Proteinas K kan hämma aktiviteten för RNas och skydda RNA från nedbrytning.
1. DNA och RNA -extraktion
DNA -extraktion: Protease K kan hydrolysera histoner som binder till DNA, vilket gör att DNA kan dissociera i lösning. Därefter avlägsnades föroreningar genom olika metoder såsom fenolkloroform extraktion, etanolutfällning etc. och renat DNA uppsamlades.
RNA -extraktion: Under RNA -extraktionsprocessen finns RNA -enzymer vanligtvis i miljön, och själva provsystemet kan också innehålla RNA -enzymer, vilket gör RNA mycket mottagliga för nedbrytning. Lägga till en liten mängd
2. Hybridiseringsteknik in situ
I hybridiseringsteknik in situ används proteinas K vanligtvis för pre -hybridiseringsbehandling för att smälta proteiner som omger mål -DNA, öka risken för sondbindning till målnukleinsyran och förbättra hybridiseringssignalen. Det bör emellertid noteras att när koncentrationen av proteinas K är för hög, matsmältningstiden är för lång, eller inkubationstemperaturen är för hög, kan det orsaka skador på cellstrukturen, vilket leder till utgjutning av vävnadssektioner och försvinnandet av cellkärnor, vilket påverkar hybridiseringsresultaten. I praktiska tillämpningar är det därför nödvändigt att strikt kontrollera koncentrationen och behandlingstiden för proteinas K.
3. Virusinaktivering och desinfektion
Proteas K, på grund av dess starka proteolytiska aktivitet, kan användas för virusinaktivering och desinfektion. Forskning har visat att behandling av rent vatten och inhemskt avloppsvatten med en viss koncentration av proteinas K kan effektivt inaktivera virus. Proteas K, som ett virus -inaktiverande desinfektionsmedel, kan minska den potentiella skadan orsakad av konventionella oxidativa kemiska desinfektionsmedel för människokroppen, och dess produktion och transport är säkra utan irreversibel miljöföroreningar.
4. Western blotting och pulselektrofores
Proteas K har också använts allmänt vid framställning av kromosom -DNA för pulserad elektrofores, Western blotting och andra experiment. I Western blot-experiment kan proteinas K användas för att ta bort icke-specifika proteiner från provet, vilket förbättrar fläckens specificitet och känslighet. I pulselektroforesexperiment kan proteinas K nedbrytning av proteinföroreningar i DNA -prover och förbättra elektroforeseffektiviteten.
5. Proteindetektering och identifiering
Proteinas K -pulverkan också användas för detektion och identifiering av vissa proteiner. I studien av överförbar spongiform encefalopati (TSE) kan till exempel proteinas K användas för att smälta proteiner i hjärnvävnadsprover, och för att identifiera närvaron av prionproteiner genom att detektera resistensen av patogena prioner till proteinas K. Dessutom kan proteinas K också användas för experiment såsom bestämning av lokaliseringen av enzymer på cellmembranerna och proteinerna Proteiner kan också användas för experiment såsom bestämning av lokaliseringen av enzymer på cellmembranerna och proteinerna Proteiner kan också användas för experiment såsom bestämning av lokaliseringen av enzymer på cellmembraner och proteiner, proteiner kan också användas för experiment, såsom bestämning av lokaliseringen av enzymer på cellmembranerna och bibehålla proteiner kan också användas för experiment såsom bestämning av lokaliseringen av enzymer på cellmembranerna och proteinerna Protein Endotoxiner (såsom lysozym och ribonukleas A).
Ansökningar inom medicin och industri
Klinisk användning: Protease K har vissa medicinska värde inom medicinen. Till exempel behandla matsmältningsbesvär med gastriskt proteas, behandling av bronkit med surt proteas, behandling av vaskulit med elastas, etc. Dessutom används trypsin, chymotrypsin, etc. också för rening av kirurgiska purulent sår och behandling av pleural serosal vidhäftningar.
Virusdetektering och diagnos: Protease K har också potentiella tillämpningar vid virusdetektering och diagnos. Genom att smälta proteinerna i virusprovet och exponera virusnukleinsyran ger det bekvämlighet för efterföljande nukleinsyratestning.
2. Industrisektor
Läderindustri: Protease K används i läderindustrin för hårborttagning och mjukgöringsbehandling, vilket kan spara tid och förbättra arbetshygienförhållandena.
Textilindustri: Protease K kan användas inom textilindustrier som silkedumming.
Livsmedelsindustrin: Protease K kan användas i livsmedelsindustrin för köttmöjligheter, alkoholförklaring etc.
Detergent: Enzym tillagd tvättmedel är en ny produkt i tvättmedel. Tvättningsmedel som innehåller alkaliskt proteas kan ta bort blodfläckar och protein smuts från kläder. Men när du använder den, var noga med att inte röra huden för att undvika att skada proteinet på hudens yta och orsaka allergiska reaktioner som utslag och eksem.
Molekylvikten av proteinas K är cirka 28900 dalton (28,9 kDa), och det finns också litteraturrapporter på 29,3 kDa. Dess aminosyrasekvens och tredimensionell rumslig struktur liknar mycket subtilisin i serinproteasfamiljen, men det finns också några unika funktioner.
Disulfidbindningsstruktur: Proteas K -molekyler innehåller disulfidbindningar, som ökar deras stabilitet och gör det möjligt för dem att upprätthålla aktivitet över ett brett pH -intervall och höga temperaturförhållanden.
CA ² ⁺ Bindningsställen:Proteinas K -pulverInnehåller två Ca ² ⁺ bindningsställen, som, även om de är långt ifrån det aktiva centrumet, är avgörande för att upprätthålla den katalytiska aktiviteten hos enzymet. Att ta bort Ca ² ⁺ kommer att få proteas att förlora cirka 80% av sin aktivitet, och återinförande av Ca ² ⁺ kan endast delvis återställa sin aktivitet.
Katalytisk triad: Protease K har en katalytisk triad ASP-HIS69-Ser224, som är en nyckelstruktur för dess hydrolytiska aktivitet.
Handlingsmekanism
Proteas K kan företrädesvis hydrolysera ester- och peptidbindningar intill C-terminalen av hydrofoba aminosyror, svavelinnehållande aminosyror och aromatiska aminosyror, hydrolyserande proteiner i korta peptider. Dess handlingsmekanism inkluderar huvudsakligen följande steg:
Enzymsubstratbindning: Efter att proteas K blandas med substratet binder substratet till det aktiva stället för enzymet och bildar ett enzymsubstratkomplex.
Katalytisk reaktion: Under verkan av det aktiva stället hydrolyseras peptidbindningen för substratet för att bilda en produkt separerad från enzymet.
Den starka nedbrytningseffekten av proteas K gör det till ett nyckelreagens i olika biokemiska reaktioner, särskilt i DNA- och RNA -extraktionsprocesser. Proteas K kan effektivt bryta ned proteiner bundna till nukleinsyror, frisätta nukleinsyror och hämma aktiviteten hos nukleaser, vilket minskar nedbrytningen av nukleinsyror under extraktion.
Lagrings- och användningsmetoder
1. Spara metod
Proteas K bör förvaras i ett kylskåp vid -20 grader för att undvika upprepad frysning och tining. Om lösningen fälls ut kan den inte användas igen. Vid framställning av proteinas K frystorkat pulver är det nödvändigt att lägga till ett frystorkande skyddande medel för att upprätthålla en hög fast innehållsnivå. Proteinas K tenderar emellertid att aggregera och bilda fällningar i koncentrationer av 20 mg/ml eller högre, vilket utgör en betydande utmaning för frittorkning med högt innehåll.
2. Instruktioner för användning
Vid användning av proteinas K är det nödvändigt att framställa en lösning av lämplig koncentration enligt experimentella krav. Vanligtvis är arbetskoncentrationen av proteinas K 0,05-0,2 mg/ml. I DNA- och RNA -extraktionsexperiment kräver extrahering av ett prov cirka 0,1 mg proteinas K. För att förbättra effektiviteten för nukleinsyraktraktion kan doseringen av proteinas K ökas på lämpligt sätt. När man använder proteinas K för hybridisering in situ, Western blotting och andra experiment är det nödvändigt att strikt kontrollera dess koncentration och bearbetningstid för att undvika att skada cellstrukturen.
Proteinas K -pulver, som ett mycket aktivt och substratspecifikt serinproteas, har ett brett utbud av tillämpningar inom biokemi, molekylärbiologi, medicin och industri. Det kan försämra proteiner som binder till nukleinsyror och frisätter nukleinsyror; Öka möjligheten för sonder att binda för att rikta in nukleinsyror i hybridiseringsteknik in situ; Används för virusinaktivering och desinfektion; Ta bort proteinföroreningar i Western blot och pulselektroforesexperiment; Har medicinskt värde inom medicinområdet; Används inom industrifält som läderbearbetning, textilindustri, livsmedelsindustri och tvättmedelstillverkning. När man använder proteinas K bör dock uppmärksamhet ägnas åt dess lagringsmetod och användningsvillkor för att säkerställa dess stabilitet och aktivitet.
Populära Taggar: Proteinas K Powder CAS 39450-01-6, leverantörer, tillverkare, fabrik, grossist, köp, pris, bulk, till salu