Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Lär känna streptavidin
Streptavidin (SA), ett utsöndrat protein som härrör från Streptomyces avidinii, har en molekylvikt på cirka 65 -66 kDa och en isoelektrisk punkt på cirka 6,0. Det är ett tetramerprotein som består av fyra homologa subenheter, var och en med ett oberoende biotinbindningsställe - vilket innebär att en molekyl streptavidin samtidigt kan binda till fyra biotinmolekyler. Dissociationskonstanten (Kd) mellan de två är så låg som cirka 10 M, vilket är en av de starkaste kända icke-kovalenta biologiska interaktionerna och kan betraktas som den mest exakta "molekylära låsmekanismen" i naturen.

Jämfört med avidin som härrör från äggvita har det oöverträffade fördelar:

Den innehåller inga glykosyleringsmodifieringar, är överlag elektriskt neutral, har därför extremt låg o-specifik bindning under fysiologiska förhållanden, ren experimentell bakgrund och utmärkt signal-till-förhållande. Dessutom har dess utmärkta motståndskraft mot denaturering och proteasnedbrytning, såväl som dess förmåga att motstå extrema pH, höga temperaturer (70-80 grader C), organiska lösningsmedel och konventionella denatureringsmedel (som SDS och urea), ersatt avidin och blivit den obestridda "guldstandarden" i biotinbindningssystem.

Det är just med dessa enastående egenskaper som det lyser inom områden som biovetenskap, in vitro-diagnostik, läkemedelsscreening och biosensing.

2. Immuntestning
Applikationen inom området immundetektion är dess mest klassiska och mest använda applikation. Sedan dess utveckling i slutet av 1970-talet har biotinstreptavidinsystemet (BAS) blivit hörnstenen i immunmärkning och spårningsanalys på grund av dess ultra-höga affinitet och kaskadförstärkningseffekt. Enligt statistik använder cirka 85 % av vanliga kemiluminescensanalysatorer BAS-baserade detektionsmetoder, vilket indikerar deras dominerande ställning.

2.1 Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA)

I ELISA kan pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (AP) kopplas och enzymet kan styras exakt till målet genom biotinylerade antikroppar. HRP katalyserar TMB-, DAB- eller ECL-luminiscerande substrat för att producera potenta kemiska eller optiska signaler, medan AP katalyserar BCIP/NBT, PNPP och andra substrat för att producera stabila färg- eller kemiluminescenssignaler. En biotinylerad målmolekyl kan binda till flera märkta streptavidin, vilket uppnår fler-signalförstärkning och möjliggör detektering av mål med låg förekomst. Denna teknik används i stor utsträckning i sandwich- och konkurrerande ELISA, och täcker scenarier som proteinkvantifiering, antikroppsdetektion, patogenscreening, etc.

2.2 Proteinimmunoblotting (Western Blot)
I Western Blot kan bindning med biotinylerade sekundära antikroppar avsevärt förbättra signalintensiteten hos målproteiner på överföringsfilmer. Jämfört med traditionella sekundära antikroppssystem kan BAS-system uppnå starkare signalförstärkning på grund av deras fyrvärda bindningsegenskaper. Dessutom, på grund av den låga icke-specifika bindningen av streptavidin, reduceras bakgrundsinterferens avsevärt, vilket gör dem särskilt lämpliga för kvantitativ analys av proteiner med låg förekomst.

2.3 Immunohistokemi (IHC) och Immunocytokemi (ICC)
HRP-märkt eller AP-märkt streptavidin är det föredragna signalförstärkningsverktyget för IHC och ICC. HRP-systemet är lämpligt för experiment som kräver extremt hög detektionskänslighet, medan AP-systemet är särskilt lämpligt för system som innehåller HRP-hämmare (som natriumazid) eller experimentella scenarier som kräver lång-färgutveckling och signalstabilitet. Genom att binda biotinylerade prober eller antikroppar till streptavidinkonjugat kan målmolekyler lokaliseras exakt i vävnadssnitt eller cellprov.

2.4 Immunfluorescens (IF) och in situ hybridisering (ISH)

Fluoresceinmärkt streptavidin (som FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) är ett universellt visualiseringsverktyg för immunfluorescensfärgning och in situ hybridisering. FITC-markören har en excitations/emissionsvåglängd på cirka 494/519 nm och uppvisar klargrön fluorescens; Våglängden för excitation/emission för PE-markören är cirka 565/578 nm, vilket är "guldstandarden" för multi-flödescytometrianalys; APC-markören täcker det bortre röda spektrumet, vilket underlättar fler-färgsavbildning. Dessa fluorescerande markörer kan exakt binda till biotinylerade antikroppar eller nukleinsyrasonder för att uppnå lokaliseringsanalys och kvantitativ detektion av målmolekyler.

2.5 Flödescytometri (FACS)

I flödescytometri används fluorescensmärkt streptavidin (särskilt PE-märkt) för att detektera cellyteantigener märkta med biotinylerade antikroppar. Dess utmärkta ljusstyrka ger ett extremt högt signal-till-brusförhållande, som effektivt kan detektera cellpopulationer med lågt ytantigenuttryck eller svaga signaler. Det är ett oumbärligt reagens i flerfärgsflödescytometrianalys-.

2.6 Enzymkopplad Immunospot Assay (ELISPOT)
AP-märkt streptavidin uppvisar utmärkta prestanda i ELISPOT och är lämpligt för fast-fasanalys och vävnads-/cellfärgningssystem. Det kan stabilt katalysera substratproduktion av räknebara punktsignaler för detektering av cytokinutsöndring på en-cellnivå.

3. Rening av proteiner och nukleinsyror
3.1 Affinitetskromatografi och proteinrening
Streptomycin är kärnkomponenten i affinitetskromatografipackning. Efter biotinmärkning av proteinet som ska renas blandas det med streptavidinagarosgel (som Streptavidin Agarose/Sepharose), och det märkta proteinet kommer nära att binda till streptavidin på fyllmedlet. Genom att tvätta för att ta bort orenheter och sedan tvätta målproteinet under lämpliga förhållanden (såsom kokande SDS-PAGE-buffert, 0,1 % SDS-behandling eller 95 % formamid+10 mM EDTA-behandling vid pH 8,2), kan produkter med hög-renhet erhållas.

Om man tar den industriella produktionen av rekombinant humant insulin som ett exempel, kan magnetiska pärlor av streptavidin av hög-kvalitet binda mer än 1200 pmol fritt biotin per milligram, och den renade proteinrenheten kan nå över 95 %.

3.2 Immunfällning (IP) och kromatinimmunfällning (ChIP)
Appliceringen av streptavidin magnetiska pärlor i immunoutfällning förbättrar avsevärt experimentell effektivitet. Forskare kan fixera biotinylerade antikroppar på streptavidin magnetiska pärlor och saminkubera dem med cellysat.

Antikropparna fångar specifikt målproteinet och dess interagerande proteiner och bildar ett "magnetisk pärlantikroppsmålprotein"-komplex. Den kan snabbt separeras under inverkan av ett externt magnetfält, med enkel användning och hög känslighet. I ChIP-experiment användes streptavidin magnetiska pärlor också för att fånga biotinylerade DNA-proteinkomplex och studera interaktionen mellan proteiner och DNA.

3.3 Dra ner experiment
I studien av protein-proteininteraktioner kan magnetiska pärlor fånga biotinylerade betesproteiner och sedan "fiska" efter preproteiner som interagerar med dem. Till exempel, när man studerar viktiga signalvägar i tumörceller, immobiliseras specifika antikroppar som känner igen P53-protein på streptavidin magnetiska pärlor och saminkuberas med tumörcellysat för att effektivt berika P53 och dess associerade proteiner. Jämfört med traditionella immunoutfällningsmetoder har magnetisk pärl-IP högre känslighet och specificitet och kan mer effektivt berika målproteiner med låg förekomst.

3.4 RNA Dra-nedåt
Magnetiska pärlor är också lämpliga för RNA pull-down-experiment. Efter bindning med streptavidin magnetiska pärlor kan biotinylerade RNA-sonder fånga proteiner som interagerar med RNA från cellysat för att studera RNA-proteininteraktionsnätverk.
3.5 Enkelsträngat DNA-beredning och nukleinsyraextraktion
Det kan binda med biotinylerade oligonukleotider för framställning av enkelsträngat DNA och effektiv extraktion av nukleinsyror, vilket spelar en viktig roll i molekylär kloning och genteknik.

4. Hög genomströmning detektion och drogscreening
4.1. TR-FRET-testplattform
Den kan kopplas med luminescerande kelater som europiumkelater för att utföra signallänkning och molekylär infångning i TR-FRET (tids-upplöst fluorescensresonansenergiöverföring) detektionssystem. Till exempel kan THUNDER™ Europiummärkt streptavidin speciellt designat för TR-FRET-experimentplattformen binda stabilt till olika biotinylerade modifierade molekyler och används ofta i proteininteraktionsanalys och preliminär screening av målläkemedel.

Detta system är homogent och hög-genomströmning, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för modern läkemedelsutveckling.

4.2 Riktad läkemedelstillförsel
Dess biotinbindande egenskaper gör den till en idealisk bärare för läkemedelsinriktade leveranssystem. Genom att koppla läkemedelsmolekyler med biotin och utnyttja den riktade bindningsförmågan hos streptavidin, kan exakt läkemedelsleverans uppnås, vilket förbättrar behandlingseffektiviteten och minskar biverkningar.

4.3 Biosensorer och biochips

Det är kärnmaterialet för produktion av biosensorer och biochips. Genom att immobilisera streptavidin på chipets yta som ett fångstelement kan biotinmärkta proteinsonder eller antikroppar immobiliseras på det, vilket uppnår hög-genomströmning och hög-känslighetsdetektion. Till exempel, vid tidig screening av proteinchips för kardiovaskulär sjukdom fixeras streptavidin magnetiska pärlor på chipsubstratet och används för att binda biotinylerade proteinsonder. Detta kan noggrant upptäcka avvikelser hos patienter i de tidiga stadierna av sjukdomen och när blodmarkörkoncentrationerna är så låga som cTnI på 0,01 ng/ml, vilket ökar det diagnostiska fönstret med 2-3 timmar jämfört med traditionella diagnostiska metoder.

5. Cellbiologi och avbildning
5.1 Cellytmärkning och fluorescerande cellsortering
Fluorescerande märkt streptavidin (som Vari Fluor 488 Streptavidin) används i stor utsträckning för cellytemärkning och fluorescerande cellsortering. Dess emissionsspektrum täcker hela spektrumet av synligt och nära-infrarött ljus, och i fler-märkningsexperiment kan den enkelt komma in i kärnan och cytoplasmisk struktur, märka målproteiner för avbildning och analys.

5.2 Nanoteknik och självmontering av material
Dess fyrvärda bindningsegenskaper gör den till en idealisk "brygga" för själv-sammansättning av nanomaterial. Genom den riktade bindningen av biotinstreptavidin kan olika nanostrukturer konstrueras för tvärvetenskaplig forskning såsom biologisk avbildning och miljöövervakning.

6. Anti-streptavidin-antikropp
Med den utbredda användningen av streptavidinbiotinsystemet har ett ofta förbisett problem uppstått - endogena anti-streptavidinantikroppar (ASA) i provet kan störa detektionssystemet. Forskning har funnit att bindningen av ASA till SA i reaktionssystemet kan påverka den korrekta konstruktionen av specifika antigenantikroppssystem, vilket resulterar i försämrad noggrannhet av koppling, detektion eller diagnostiska resultat.

För att möta denna utmaning har anti-streptavidin-antikroppsdetektionskit dykt upp, som kan användas för att detektera endogent ASA i patientprover och undvika dess störning med BAS-systemet. Roche Custom Biotech har utvecklat en inaktiv streptavidinmutant (Streptavidin rec. inactive, poly), som kan läggas till det nuvarande systemet utan ytterligare steg för att specifikt blockera och eliminera ASA-interferens, vilket förbättrar noggrannheten och specificiteten hos detektionssystemet.

7. Biotininterferens
Även om streptavidinbiotinsystemet är kraftfullt står det inför en allt svårare utmaning - biotininterferens.

När det finns en hög koncentration av fritt biotin i testprovet, konkurrerar det med biotinylerade antikroppar om bindningsstället för streptavidin, vilket resulterar i förvrängda detektionsresultat.

Oral administrering av 100 mg biotin kan leda till en maximal plasmakoncentration på 375-450 ng/ml; Patienter med multipel skleros kan ta 300 mg/d oralt, och deras plasmabiotinnivåer kan överstiga 1000 ng/ml; Dagligt intag av 500 mg biotin kan leda till extremt höga koncentrationer av biotin i blodet. I sandwich-immunanalyser kan överskott av biotin ge felaktiga låga resultat; I konkurrenskraftiga immunanalyser kan det leda till felaktiga höga resultat.

Flera studier har visat att TSH, tyroxin PTH, endokrina tester såsom adrenokortikotropt hormon, prolaktin, testosteron, kortisol, samt tumörmarkörer och hjärtfunktionella markörer, alla påverkas i varierande grad av biotininterferens. FDA har successivt utfärdat varningsinformation och motsvarande riktlinjer. Copingstrategierna inkluderar: serieutspädning av prover, byte till icke-BAS-metoder såsom vätskekromatografi-masspektrometri, omtestning efter biotinclearance (så kort som 2 timmar, så länge som 15 dagar eller till och med månader), eller användning av fria biotinrensare.