GLP-1(länk:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) är ett polypeptidhormon som består av 30 aminosyror. Med den djupgående forskningen om GLP-1 har fler och fler syntetiska metoder utvecklats. Den här artikeln kommer systematiskt att introducera de för närvarande kända syntesmetoderna för GLP-1.
Metod 1, fastfassyntes:
Fastfassyntes är en allmänt använd metod för peptid- och proteinsyntes och används också ofta för syntes av GLP-1. Vid fastfassyntes bildas kärnstrukturen genom att den första aminosyran kopplas till hartset. Därefter tillsätts nästa aminosyra i sekvens och reageras kemiskt med ett lämpligt kondensationsmedel. Slutligen kan målprodukten erhållas genom att klyva polypeptiden från hartset.
Vikten av fastfassyntes är att den möjliggör automatisering och storskalig produktion av peptidsyntes. De nuvarande vanliga fastfassyntesmetoderna inkluderar Fmoc och Boc. Bland dem använder Fmoc-metoden N-Fmoc-skyddsgruppen för att skydda peptiden, medan Boc-metoden använder tert-butyloxikarbonyl för att skydda karboxylgruppen.
Metod två, flytande fassyntes:
Vätskefassyntes är en traditionell metod för peptidsyntes där reaktanterna placeras i vätskefasen för reaktionen. Fördelen med vätskefassyntes är att reaktionsbetingelserna är milda och lämpliga för modifiering av känsliga kemiska strukturer. Men på grund av för många reaktanter är reningsprocessen relativt besvärlig. Kemiska reaktioner i vätskefassyntes inkluderar:
1. Kondensationsreaktion:
Kondensationsreaktion är en av de mest grundläggande reaktionerna i peptidsyntes, det vill säga karboxylgruppen som initieras av kondensationsmedel som DCC och HOBt är kopplad till aminogruppen i aminosyran genom acyleringsreaktion. Reaktionsbetingelserna är milda och utbytet är högt.
2. Eliminationsreaktioner:
Elimineringsreaktionen är att reducera metioninet till ditiolen med NaBH4 och andra reduktionsmedel, vilket gör det inaktivt. Reaktionen måste utföras under grundläggande betingelser.
3. Avlägsnande av skyddsgrupper:
På grund av aminosyrornas olika funktioner i peptidkedjan kommer olika skyddsgrupper att användas för skydd. Efter att syntesen är klar måste den skyddande gruppen avlägsnas. För Fmoc-metoden används piperidin vanligtvis för att avlägsna Fmoc; medan för Boc-metoden används TFA för att ta bort Boc.
Metod tre, kemisk syntes:
GLP-1 är ett polypeptidhormon med viktiga biologiska aktiviteter. Dess syntes kan realiseras med olika metoder, bland vilka kemisk syntes är en av de mest använda metoderna. Fördelen med kemisk syntes är att den kan producera mycket rena målprodukter, som är lämpliga för storskalig produktion. Den kemiska syntesmetoden och detaljerade steg för GLP-1 kommer att introduceras nedan.
1. Val av syntetisk väg och skyddsgrupp:
GLP-1-molekylen består av 36 aminosyror, inklusive 21 aminosyror av L-typ och 15 D-typ. Innan syntesen utförs är det nödvändigt att välja en lämplig syntesväg och välja motsvarande skyddsgrupp enligt de syntetiska förhållandena. Fmoc fastfassyntes används vanligtvis för automatiserad storskalig syntes. Denna metod använder N-9-fluoroimidokarboxylskydd (N-Fmoc) som en skyddsgrupp, och måste också välja en lämplig sekundär skyddsgrupp (som tert-butyl eller metyl) för att säkerställa skyddet av specifika platser. Varje gång en ny aminosyra tillsätts måste Fmoc-skyddsgruppen tas bort först, och sedan tillsätts den skyddade kopplingssubstansen för nästa aminosyra.
2. Syntes av kärnaminosyrasekvensen:
Kärnsekvensen för GLP-1 består av 21 aminosyror, inklusive ett nyckelserin och fyra prolylglutaminsyradipeptidsekvenser. I fastfassyntes kan syntesen av kärnsekvensen delas in i följande steg:
2.1. Tillsätt ättiksyrakarbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) och 2-Cl-Trt-Cl till fastfas syntetisk harts och utför kondensationsreaktion med DIC/NMM-kopplingsmedel.
2.2. Ta bort Fmoc-skyddsgruppen genom att avskydda gruppreaktionen.
2.3. Lägg till nästa aminosyra, upprepa steg 1 och steg 2 i sekvens tills kärnsekvensen är syntetiserad.
2.4. Bildning av pentapeptidstrukturer på fastfasharts. Tillsätt acetaliseringsreagenset till hartset i fast fas, reagera med det N-terminala igenkänningsmedlet (såsom HBTU), tillsätt sidokedjeskyddsgruppen av serin som ett extra reduktionsmedel och ta sedan bort Fmoc-skyddsgruppen.
2.5. Under katalys av Bacillus subtilis-transferas (ProTide) genomgår pentapeptidstrukturen en utbytesreaktion med prekursorn för serinjodacetat.
3. Syntes av den återstående aminosyrasekvensen:
Efter att ha slutfört syntesen av kärnsekvensen är det nödvändigt att fortsätta att lägga till de återstående aminosyrorna, inklusive aminosyror av L- och D-typ. Tillsatsen av dessa aminosyror måste börja från kärnsekvensen, lägga till nästa aminosyra i sekvensen och använda motsvarande kondenseringsmedel för att utföra kemiska reaktioner tills en fullständig GLP-1-polypeptidmolekyl har syntetiserats. Under denna process är det också nödvändigt att välja en lämplig skyddsgrupp efter behov, och att utföra reaktionsstegen, avlägsnande av skyddsgrupp och tillsats av aminosyra i sekvens.
4. Natriumhydroxidbehandling:
Efter att alla aminosyrorna har tillsatts bildas en ofullständigt syntetiserad peptidkedja på fastfas-hartset och måste bearbetas för att bilda en fullständigt bildad peptidmolekyl. För det första bör den oformade peptiden hydrolyseras med natriumhydroxid, så att den C-terminala karboxylgruppen som ursprungligen var fäst vid hartset lösgörs från hartset och skyddsgruppen lösgörs i vatten. Efter hydrolysreaktion erhålls målprodukten.
5. Nederbörd och tvätt:
Efter behandlingen behandlas den hydrolyserade lösningen med syra för att fälla ut målprodukten. Därefter återsuspenderades pelleten i vatten, följt av intensiv tvättning för att avlägsna föroreningar.
6. Rening:
Det sista steget är rening av den önskade produkten, vanligtvis med hjälp av högpresterande vätskekromatografi. Under denna process kan produktens renhet bestämmas genom att detektera toppen av lösningen i masspektrumet. Kort sagt, den kemiska syntesen av GLP-1 kräver flera omgångar av komplexa reaktioner och strikta reningsprocesser för att slutligen få den aktiva målprodukten.
Metod fyra, biosyntes:
GLP-1 är ett viktigt polypeptidhormon med olika fysiologiska effekter, inklusive främjande av insulinutsöndring, undertryckande av aptit, minskad kroppsvikt och bibehållen insulinkänslighet, etc. Biosyntesmetoden för GLP-1 syntetiseras huvudsakligen av L-celler i bukspottkörteln, och dess synteshastighet regleras med dietintag. De detaljerade stegen introduceras enligt följande:
1. Förberedande arbete före syntes:
Innan biosyntesen av GLP-1 måste en del förberedande arbete göras, inklusive att bestämma vilken celltyp som används, ställa in odlingsförhållandena och välja lämpligt katalytiskt enzym. L-celler är huvudkällan till GLP-1-syntes eftersom de innehåller prekursorer till två hormoner, GIP (glukagonliknande peptid 1) och GLP-1. L-celler kan isoleras från tarmepitelet hos kaniner eller möss. Före biosyntes måste cellerna odlas till ett tillräckligt antal och tillräckligt med näringsämnen och lämpliga odlingsförhållanden bör tillhandahållas. Dessutom är det nödvändigt att välja det lämpliga katalytiska enzymet för att främja reaktionen.
2. Syntes och bearbetning av prekursorer:
Biosyntesen av GLP-1 sker huvudsakligen i L-celler, och dess prekursor består av två hormoner, GIP och GLP-1. Efter att ha kommit in i endokrina celler bearbetas GIP och GLP-1 av proteolytiska enzymer och klyvs till individuella peptider. En serie enzymer och kofaktorer är involverade i denna process, inklusive prekursorpolypeptidacidas (PC2), isomeras och sena adhesionsfaktorer.
3. Ömsesidig omvandling mellan polypeptidsegment:
Efter bearbetning kombineras GIP- och GLP-1-peptiderna för att bilda GLP-1-polypeptiden. Denna process kräver användning av glukagonliknande peptid 1 (GLP-1) som en mall till vilken andra individuella peptider kombineras för att bilda nya sammansatta polypeptider. Denna process kräver också vissa specifika enzymer och faktorer, inklusive Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) och Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1-sekretion:
Efter att GLP-1 har syntetiserats och bearbetats, lagras det i cytoplasman och inre vesiklar i endokrina celler. När de stimuleras av kosten frisätter endokrina celler GLP-1 och kommer in i blodcirkulationen genom mikrokärl. Denna process regleras och kontrolleras genom en serie signaltransduktionsvägar, inklusive cAMP-Ca2 plusoch så vidare.
Kort sagt, biosyntesen av GLP-1 involverar en gemensam åtgärd av flera länkar och faktorer. Kombinationen av biosyntes och kemisk syntes kan ge en bättre grund och stöd för forskning och produktion av GLP-1.
Metod fem, enzymatisk syntes:
Enzymatisk syntes är syntesen av peptidkedjor genom katalys av biologiska enzymer. Jämfört med traditionella syntesmetoder i vätskefas kan enzymatisk syntes utföras vid rumstemperatur och ett brett utbud av råmaterial kan väljas. Enzymer som teta-vätskesyntas, AEP, ACE, etc. används vanligtvis för att katalysera syntesen.
Sammanfattningsvis är de ovan nämnda metoderna genomförbara metoder för GLP-1-syntes. Olika metoder är lämpliga för olika experimentella förhållanden och läkemedelsproduktionsmiljöer.