Hur påverkar IPTG-reagens den posttranslationella modifieringen av proteiner?

Innan vi dyker in i hur IPTG påverkar post - translationell modifiering, låt oss snabbt gå igenom vad post - translationell modifiering är. Efter att ett protein har syntetiserats från mRNA i en process som kallas translation, genomgår det ofta olika kemiska modifieringar. Dessa modifieringar kan förändra proteinets struktur, funktion, stabilitet och dess förmåga att interagera med andra molekyler. Några vanliga posttranslationella modifieringar inkluderar fosforylering, glykosylering, acetylering och ubiquitinering.

IPTG används i stor utsträckning som en inducerare vid uttryck av rekombinanta proteiner i bakterier, särskilt i E. coli. I E. coli är lac-operonet en uppsättning gener som är involverade i laktosmetabolismen. Normalt är lac-operonet undertryckt, men när IPTG läggs till kulturen binder det till lac-repressorproteinet, vilket orsakar en konformationsförändring. Denna förändring frigör repressorn från operatorregionen av lac-operonet, vilket gör att RNA-polymeras kan binda och transkribera generna nedströms, inklusive genen som kodar för det rekombinanta proteinet vi är intresserade av.

Fosforylering

Fosforylering är en av de viktigaste posttranslationella modifieringarna. Det kan reglera proteinaktivitet, lokalisering och interaktioner. När IPTG används för att inducera proteinuttryck kan det indirekt påverka fosforylering. Till exempel kan överuttrycket av ett protein inducerat av IPTG leda till en obalans i cellens kinas-fosfatassystem. Vissa kinaser kan vara överväldigade med den stora mängden substrat (det nysyntetiserade proteinet), vilket leder till antingen under- eller över-fosforylering.

Dessutom kan den ökade metaboliska aktiviteten i cellen på grund av proteinöveruttryck förändra tillgängligheten av ATP, som är fosfatdonatorn för fosforyleringsreaktioner. Detta kan ytterligare störa de normala fosforyleringsmönstren för det uttryckta proteinet.

Glykosylering

Glykosylering är tillsats av kolhydratgrupper till proteiner. Bakterier som E. coli, som vanligtvis används för proteinuttryck med IPTG, har inte samma glykosyleringsmaskineri som eukaryota celler.

Däremot kan närvaron av IPTG-inducerat proteinuttryck fortfarande ha en inverkan. Den ökade efterfrågan på cellulära resurser under proteinöveruttryck kan leda till brist på nukleotidsocker, som är byggstenarna för glykosylering. Detta kan resultera i ofullständiga eller onormala glykosyleringsmönster om proteinet har potentiella glykosyleringsställen.

Acetylering

Acetylering är en annan viktig post-translationell modifiering som kan påverka proteinstabilitet och funktion. IPTG - inducerat proteinuttryck kan förändra den intracellulära miljön. Till exempel kan den ökade produktionen av proteiner förändra nivåerna av acetyl - CoA, som är acetyldonatorn för acetyleringsreaktioner. Om nivåerna av acetyl - CoA är utarmade på grund av proteinuttryck på hög nivå kan det leda till minskad acetylering av det uttryckta proteinet.